Истина это то, что выдерживает проверку опытом



Скачать 290.14 Kb.
Дата11.08.2018
Размер290.14 Kb.

Истина - это то, что выдерживает

проверку опытом.

(Альберт Эйнштейн)
12. Биосенсоры
Интерес к биосенсорам в Казанском университете как объектом исследования относится ка периоду конца 70-х и начала 80-х годов прошлого века. Тематика работ по биосенсорам была навеяна проблемами определения различных биологически активных веществ с сильно выраженными токсическими свойствами на случай риска их возможного появления в окружающей среде. Первые задачи были сформулированы военными химиками. Среди специалистов - химиков, которые правильно оценили важность исследования и разработки биосенсоров для этих целей следует упомянуть профессора Ю.М.Каргина (физико-химик) и профессора В.Г.Винтера (биохимик).

Именно в начале 80-х годов в ходе обсуждения с этими специалистами проблематики использования реагентов нового поколения со специфическими свойствами обозначились перспективы их практического применения. В тот период к этим реагентам были отнесены ферменты или содержащие их биоматериалы, а также ДНК, которые можно было использовать для создания соответствующих аналитических устройств для определения токсикантов-загрязнителей: в частности, различных ферментных датчиков, или биохимических сенсоров, как потом их стали называть. Стоит отметить интересную деталь. Военные химики обратились со своим предложением прежде всего к Ю.М.Каргину, заведующему кафедрой физической химии КГУ. А он, в свою очередь, "перепроводил " их на кафедру аналитической химии. С этого момента и появилась тематика биосенсоров в КГУ.


2.1. Ферментативные методы
В сотрудничестве со специалистами по вольтамперометрическим анализаторам во главе с профессором М.Р.Вяселевым (Казанский авиационный институт, кафедра теоретической радиотехники и радиоэлектроники) по техническому заданию военных химиков одного из НИИ г.Казани за сравнительно короткий период времени на кафедре аналитической химии КГУ был разработан ряд способов определения этого типа веществ на вольтамперометрическом комплексе, позволяющем по модельному поведению некоторой группы отдельных токсикантов установить природу и содержание действующего начала в объекте анализе. Комплекс предназначался для работы в автономных условиях. Тогда эта идея была достаточно смелой и новаторской и она была реализована в действующем макете прибора со своим программным обеспечением.

Если с неорганическими соединениями дело было достаточно ясно, и в целом идея вольтамперометрического определения могла быть осуществляемой на практике, то в случае с органическими токсическими веществами требовались новые подходы.

Небольшая группа исследователей под руководством Г.К.Будникова уже к середине 80-х годов разработала ферментные электроды на основе иммобилизованной в нитроцеллюлозную пленку холинэстеразы и стационарного ртутного электрода с серебряной подложкой, который выполнял функцию физического преобразователя. Эти электроды предназначались для определения концентрации тиохолиновых эфиров, хлорофоса и прозерина, ингибиторов и активаторов холинэстеразы. Устройства и способы определения были защищены авторскими свидетельствами. Выбор нитроцеллюлозы как материала для инкапсулирования фермента в общем-то оказался по существу случайным, но удачным.

Стационарный ртутный электрод с серебряной подложкой в то время казался наиболее простым по устройству, и воспроизводимости его поверхности, а отсюда и результатов измерений, которые были в целом достаточно удовлетворительными. Опыт конструирования такого электрода, или преобразователя (трансдьюсера), как сейчас его называют, рассматривая в целом биосенсор или биосенсорное устройство, был приобретен Г.К.Будниковым еще во время стажировки в Полярографическом институте Чехословацкой академии наук в г.Праге в 1961 - 1962 годы. Тогда этот электрод был впервые предложен доктором К.Мицкой.

Рисунок изображает схему биосенсорного устройства на основе иммобилизованной холинэстеразы и упомянутого стационарного электрода, впервые использованного в работе и описанного в статье, опубликованной в "Журнале аналитической химии" (Г.К.Будников, Э.П.Медянцева, А.В.Волков и С.С.Аронзон. Ферментный электрод на основе иммобилизованной холинэстеразы //Журнал аналит. химии. 1983, Т.38, № 7. С.1283-1288). Хотя эта конструкция биосенсора предполагала использование сравнительно больших объемов растворов, а отсюда и расхода реагентов, она оказалась достаточно простой и воспроизводимой. Небольшие изменения в рецептуре получения пленок с иммобилизованным биоматериалом были внесены в последующие годы. Но в целом метод инкапсулирования фермента оставался почти неизменным, как и общая схема самого биосенсорного устройства, в течение почти двух десятилетий.

Рис.


Схематическое изображение биосенсорного

устройства на основе иммобилизованной

холинэстеразы и стационарного ртутного

капельного (пленочного) электрода:

1 - корпус; 2 - серебряная проволока;

3 - токоотвод; 4 - гофрированная пленка

из нитроцеллюлозы с включенной холин-

эстеразой; 5 - прижимное кольцо

Стационарный ртутный электрод обеспечивал при небольших потенциалах электронакопление меркаптида, продукта ферментативного гидролиза бутирилтиохолиниодида, являющегося субстратом холинэстеразы. За счет этого электронакопления и достигалась высокая чувствительность определения как самого тиохолинового эфира, так и ингибитора фермента, если он присутствовал в анализируемом растворе.

На одной из Итоговых научных конференций КГУ того периода был сделан доклад по результатам исследований и разработок, которые проводились по линии хозяйственного договора с одним из НИИ г.Казани (Г.К.Будников). Речь шла о возможностях вольтамперометрического комплекса, упомянутого выше и предназначенного для проведения мониторинга, или как сейчас говорят, в полевых условиях. Это был своего рода отчет о работе за весь период действия договора от имени всех участников сотрудничества. Положительная реакция аудитории при ответах на вопросы (на конференции присутствовал и задавал вопросы академик Б.А.Арбузов) подтвердила мнение, что не всякая прикладная задача может решаться традиционными способами. Новые, т.е. продвинутые методы требуют фундаментальных проработок, что и было подтверждено в дальнейшем.

Здесь уместно вспомнить, что в то время НИЧ КГУ подразделял хоздоговорные работы на три категории: фундаментальные, прикладные и прочие, к которым относился, в частности, обычный рутинный анализ. Жизнь в дальнейшем показала, что граней между фундаментальными и прикладными исследованиями не существует, особенно это касается проблемно ориентированных работ с четко обозначенной целью, относящихся, как сейчас говорят, к финальной науке. В аналитической химии такое случается довольно - таки часто.

Исследования по тематике биосенсоров в тот период, как и в последующие годы, проводили, как правило, с привлечением аспирантов и студентов дипломников, поскольку специализированной лаборатории на кафедре не было.

Основное внимание уделяли оптимизации амперометрического отклика разработанных биосенсоров, оценке факторов, влияющих на сигнал, состава раствора, моделирующего, по возможности, реальные объекты анализа. В тот же период была реализована идея использования денатурированной ДНК как модификатора в составе биохимической части устройства, что позволило продемонстрировать расширение аналитических возможностей холинэстеразного биосенсора для определения различных антител на принципах иммуноферментного анализа. В итоге был предложен биосенсор на основе иммобилизованной холинэстеразы, выполняющей функцию преобразователя (но уже нефизического) с использованием взаимодействия антиген - антитело. В создании такого биосенсора был предложен новый подход, который и привел к разработке варианта ингибиторного иммуно-ферментного анализа. Он был использован для диагностики и оценки тяжести аутоиммунного заболевания - алеутской болезни норок, которая была объектом исследования на кафедре биохимии КГУ, проводимого под руководством В.Г.Винтера. В тематике кафедры появилось иммуно-химическое направление исследований.
12.2. Иммуно-химические реакции
По существу в этих исследованиях вольтамперометрически с помощью стационарного ртутного электрода контролировали ход иммуно-химической реакции (Г.К.Будников, Э.П.Медянцева, С.С.Бабкина). Примеры подобных работ в литературе тех лет практически отсутствовали и было решено продолжить это направление, по которому затем был опубликован ряд статей как в отечественных, так и зарубежных журналах, в том числе и в журнале "Analytical Chemistry". Эта статья, вероятно, первая в журнале, имеющем один из самых высоких импакт-факторов среди журналов по аналитической химии, подготовленной химиками Казани вообще. Понятно, что мог появиться соблазн "приобрести" ее авторов с планами подобных публикаций.

В начале 90-х годов в тематике биосенсоров на кафедре аналитической химии существенных изменений не произошло. Исследования продолжались достаточно интенсивно в направлении улучшения аналитических характеристик ферментных электродов на основе холинэстеразы, разработанных ранее, количественной оценке факторов, определяющих срок их службы, разработки ряда конкретных методик определения ингибиторов холинэстеразы (в основном, фосфорорганических соединений) в модельных системах.

Получают развитие новые варианты иммуноферментного анализа. В частности, биосенсорная часть устройства модифицируется компонентами биоспецифического взаимодействия (специфическими иммуноглобулинами G кролика). Разрабатывается способ определения вируса крапчатости гвоздики на весьма низких уровнях концентраций возбудителя. Оцениваются константы связывания этого гетерогенного иммунокомплекса и другие параметры, характеризующие работу и отклик биосенсора на присутствие биологически активных веществ (Г.К.Будников, Э.П.Медянцева, Ли Фа-Шень). Было показано, что на каталитическую активность иммобилизованной холинэстеразы активирующее действие в модельных системах оказывают ионы щелочно-земельных металлов.

Кинетические параметры ферментативной реакции гидролиза бутирилтиохолиниодида, вычисленные по данным вольтамперометрических измерений в присутствии и в отсутствие металлов - активаторов, использованы для определения активирующей (констант активирования) способности ионов щелочноземельных металлов и вида активации. Были разработаны новые подходы к селективному определению ингибиторов холинэстеразы, основанные на использовании иммунохимических реакций и холинэстеразного биосенсора, сочетающие специфичность реакций образования иммунных комплексов с высокой чувствительностью регистрации амперометрического сигнала. Были найдены условия получения антител и условия проведения иммунохимических определения загрязнителей, предшественников диоксинов, 2,2-D и 2,4,5- Т, с использованием как растворов, так и иммобилизованных в нитроцеллюлозной мембране антител. Нижняя граница определяемых содержаний этих токсикантов составила ~ 10-11моль/л (аспирантская работа М.Г.Вертлиб).

К концу 1999 года в рамках этой тематики была защищена еще одна кандидатская диссертаций, в которой идеи иммунохимического анализа, проводимого с применением холинэстеразного биосенсора, были перенесены на разработку новых способов определения антигенов Candida albicans и Phytophtora infectans, а также некоторых гербицидов триазинового ряда (М.П.Кутырева). Разработка новых вариантов иммунохимического анализа с применением холинэстеразного биосенсора успешно продолжается и сейчас (Э.П.Медянцева).

Кроме холинэстеразы в составе биочувствительной части амперометрического биосенсора использовали и другие ферменты, в частности, L-цистеиндесульфогидролазу и моноаминооксидазу (аспирантская работа Н.В.Кремлевой). Биосенсоры на основе иммобилизованной холинэстеразы и стационарного ртутного электрода как нестандартного средства измерения (аспирантская работа О.В.Федосеевой) для использования в полевых условиях не подходили. Требовались другие устройства на иных физических преобразователях, менее объемные по конструкции, которые могли бы найти применение не только в стационарных лабораториях, но и в полевых условиях.

К проблеме биосенсоров проявляет интерес Научный совет по аналитической химии АН СССР. В программу сессии НСАХ в 1991 году был включен доклад по биосенсорам (Г.К.Будников). Группа специалистов по химическим сенсорам, которые работали в различных НИИ и вузах страны, при координации со стороны Института геохимии и аналитической химии имени В.И.Вернадского АН СССР подготовила доклад по этому направлению науки, в котором биосенсорам было уделено заметное внимание. Этот раздел доклада был составлен Г.К.Будниковым. В частности, в докладе отмечались вопросы миниатюризации биосенсоров для медицинских целей и проблема создания портативных устройств для измерений в автономных условиях, или, как еще говорят, в полевых.

Эта проблема имеет непосредственное отношение к проведению эколого-аналитического мониторинга и контроля окружающей среды, и она решалась в другой группе исследователей, которая располагалась на кафедре прикладной экологии КГУ.

К числу интересных событий, произошедших, как и ряд других за рубежом, связанных с тематикой биосенсоров КГУ, можно отнести и встречу в одном из ресторанов Лондона Г.К.Будникова, Г.А.Евтюгина и С.А.Еремина с видными английскими биохимиками, специалистами по иммуно-химическому анализу, докторами Смитом и Лондоном в ноябре 2001 года. Эта встреча превратилась по существу в семинар без протокола, на котором обсуждались (среди прочих) проблемы качества реагентов для проведения иммуно-химического анализа. Здесь С.А.Еремин (партнер кафедры по биосенсорам) себя проявил как опытный специалист, знающий ситуацию на рынке реагентов и возможные области их применения.

Разделение тематики по биосенсорам в КГУ на два направления (условно ферментное и иммуно-химическое) не было случайным. Во-первых, уже был опыт по иммуно-химии (С.С.Бабкина), который интересно было продолжить. Во-вторых, Г.А.Евтюгин успешно двигался в поиске новых электродов и выяснении причин и факторов, влияющих на отклик биосенсора. Европейская конференция по электроанализу в 1996 году (г.Дарем, Англия) ознакомила с новыми типами планарных электродов. В опубликованных отчетах о поездке и статье (Заводская лаборатория, 1997 г.) Г.К.Будников подробно рассказал об этих электродах для вольтамперометрии, из которых некоторые представляли интерес при конструировании биосенсоров как физические преобразователи. Сотрудничество Г.А.Евтюгина с Ж.-Л.Марти (Перпиньянский универститет, Франция) позволило провести эксперименты с новыми планарными электродами уже в 1997 - 1998 годах. Естественно такая ситуация нашла отражение в формулировках названий проектов, подаваемых на конкурс грантов РФФИ. Разделение тематики по биосенсорам в итоге способствовало повышению интенсивности работ, судя по числу публикаций.

Рисунок иллюстрирует общий вид планарных амперометрических биосенсоров для определения загрязнителей окружающей среды, содержащих на своей поверхности иммобилизованную ацетилхолинэстеразу. Вместе с тем он показывает прогресс конструирования таких устройств за весь период исследования и разработок по тематике биосенсоров КГУ.
12.3. Биосенсорика
С середины 90-х годов работы ведутся совместно двумя кафедрами. Полученные в последнее время результаты позволяют говорить о переходе от различных фрагментарных данных к концепции конструирования биосенсоров, алгоритмам направленного изменения чувствительности и селективности биосенсоров в отношении определяемых соединений - субстратов и эффекторов ферментов.

К исследованиям по биосенсорике, как стали называть сравнительно недавно эту область науки, на экологическом факультете приступили в 1989 - 1991 годах - самое начало формирования факультета. В то время это был единственный экологический факультет на всем пространстве Советского Союза. На кафедре прикладной экологии, куда перешли сразу 4 сотрудника кафедры физической химии КГУ во главе с профессором В.З.Латыповой, выбор тематики исследований был сделан под непосредственным влиянием Г.К.Будникова и заведующего кафедрой микробиологии профессора Е.Н.Офицерова, которые хорошо представляли перспективы этого научного направления в решении задач эколого-аналитического контроля, в том числе и полевых условиях.

Не дублируя работ, проводимых на кафедре аналитической химии группа сотрудников экологического факультета КГУ (к.х.н. Г.А.Евтюгин, к.х.н. Д.А.Семанов и др.) ориентировалась в основном на решение задач практического использования биосенсоров, апробацию создаваемых образцов этих устройств в условиях реального мониторинга объектов окружающей среды.

Можно выделить три этапа исследований. На первом этапе внимание было уделено изготовлению первых препаратов, стабилизированных и иммобилизованных ферментов и конструированию биосенсоров. Приоритет был отдан самым простым для использования средствам измерения - стеклянным рН-электродам, покрытым слоем иммобилизованного фермента. Первые результаты были получены с использованием модификации метода инкапсулирования холинэстеразы, разработанного ранее на кафедре аналитической химии, о чем говорилось выше. На этапе становления этого направления большую помощь оказали постоянные консультации и поддержка д.х.н. Е.Б.Никольской, ст.н.с. Института физиологии и биохимии имени И.М.Сеченова РАН (Санкт-Петербург). Неоднократные выступления Е.Б.Никольской с лекциями в КГУ, несомненно, ускорили вхождение в область биосенсоров, поскольку в то время Е.Б.Никольская была одним из немногих специалистов по ферментативной кинетике, имеющего в то же время большой опыт исследовательской работы как физико-химик. Завершением этого же этапа можно считать создание первых работоспособных холинэстеразных потенциометрических биосенсоров, на основе бумажных мембран, и первые масштабные полевые испытания биосенсоров, проведенные в Волго-Ахтубинской пойме (аспирант Р.Р.Искандеров, 1991-1992 гг.).

К 1993-1994 годам были сформулированы основные направления проводимых исследований, предопределившие развитие биосенсорики в последующий период времени:

- исследование факторов, влияющих на чувствительность и селективность определения ингибиторов с помощью иммобилизованных ферментов;

- оптимизация способов пробоподготовки применительно к особенностям функционирования ферментов и специфика матрицы реального объекта контроля;

- биосенсоры как биоиндикаторы общего уровня загрязнения токсического эффекта.

Завершением этого этапа работы можно считать защиту кандидатской диссертации Р.Р.Искандерова, защищенной по двум специальностям на Совете при Казанском химико-технологическом институте.

На втором этапе исследований на кафедре прикладной экологии при активном сотрудничестве с кафедрой аналитической химии КГУ эффективность исследований резко повысилась. Активно работает в области биосенсорики молодежь: Е.Е.Стойкова, студентка, затем аспирантка кафедры аналитической химии, работавшая под руководством профессора Г.К.Будникова и доцента Г.А.Евтюгина (в настоящее время - ассистент кафедры КГУ), студенты, а затем аспиранты кафедры прикладной экологии С.В.Белякова и Э.В.Альфонсова (Гоголь) и кафедры аналитической химии А.Н.Иванов. Удается сформировать единую цепочку преемственности "студент - аспирант - сотрудник", что резко повысило результативность исследований. Начиная с 1996 года, публикуются 4 - 5 статей в год, в том числе и международных журналах. Появляются пластиковые накладные ферментсодержащие мембраны, исследуется влияние носителя фермента, условий иммобилизации, способы детектирования ферментативной реакции на аналитические характеристики определения загрязнителей окружающей среды. Помимо потенциометрических сенсоров развиваются различные варианты амперометрических и фотометрических биосенсоров, в том числе и в проточно-инжекционных условиях. Начинается процесс активной смены элементной базы биосенсоров.

Первый доклад, в котором обобщались результаты совместной работы по ингибиторным биосенсорам, был сделан осенью 1995 года (Международная конференция по кинетике в аналитической химии, Москва). На следующий год на V Европейской конференции по электроанализу (ESEAC - 96), которая состоялась в г. Дарем (Великобритания) на базе университета этого города, устный доклад (Г.К.Будников) привлек внимание уже не только оргкомитет конференции. Возможности биосенсоров в экоаналитическом мониторинге обсуждались и в секционном докладе, представленном Г.К.Будниковым на Международном Конгрессе по аналитической химии (г.Москва, 1997г.) по предложению академика Ю.А.Золотова. Во время конгресса, в частности, было подтверждено согласие войти в совместную с кафедрой химической энзимологии МГУ работу в рамках международного проекта (координатор к.х.н. С.А.Еремин). Удается войти в незримый коллектив международного сотрудничества по биосенсорной тематике. По результатам конкурса, проведенного Европейской комиссией по биосенсорам для мониторинга в полевых условиях был получен грант (INCO - COPERNICUS, грантодержатель - Афинский университет, Афины, Греция, 1997-2001 гг.). Грант предназначался для поездок на международные семинары по биосенсорам и для краткосрочных командировок в ведущие лаборатории Европейских стран, объединенные этим грантом. В рамках проекта в течение этого периода два раза в год проводились семинары. Было сделано пять выступлений на семинарах: Братислава (Словакия)- 1997 г., Афины - 1997 г., Коимбра (Португалия) и Кордова (Испания) - 1998 г. Международные связи укрепились, кроме того, в ходе обсуждения биосенсорной проблематики во время поездок в исследовательские центры. Так, Г.А.Евтюгин посетил лабораторию М.Смита в университете г.Дублина (Ирландия), а Г.К.Будников и Г.А.Евтюгин - лабораторию Ж.- Л.Марти в университете г.Перпиньян (Франция). С двумя лекциями по биосенсорной тематике, связанной с проблемами применения биосенсоров в эколого-аналитическом мониторинге, выступил Г.К.Будников в Пекинском университете технологии и бизнеса и на семинаре одного из институтов Всекитайской академии наук по окружающей среде (2000 г.). Международное сотрудничество продолжается и сейчас, но уже в рамках гранта INTAS. Практически все отчеты о результатах поездок на международные конференции и семинары были опубликованы в "Журнале аналитической химии" в разделе "Хроника", а также в журнале "Химия в интересах устойчивого развития". Кроме этого публикуются обзорные статьи в журналах "Успехи химии", "Российском химическом журнале", "Talanta" (Г.К.Будников, Г.А.Евтюгин).

Что касается биосенсорной тематики, связанной с использованием иммунохимических реакций (группа Э.П.Медянцевой), то это направление было также поддержано европейским грантом INCO - COPERNICUS (при активном патронаже со стороны к.х.н. С.А.Еремина).

В итоге Казань стала общепризнанным центром по биосенсорам. Научно-популярные статьи и заметки по биосенсорам были опубликованы в журнале "Химия и жизнь", в Соросовском образовательном журнале, в Соросовской и Татарской энциклопедиях, информация по исследовательской группе и проводимых работах КГУ помещена на сайте университета в Интернете (Г.А.Евтюгин). Это было первым размещением в интернете на сайте российского университета подробной информации по биосенсорам. Она уделяет основное внимание в этой области знаний не техническим деталям, а тому, как можно организовать поиск и получить необходимые сведения. Число регистрируемых посещений этого сайта показало, что труд по его организации не пропал даром и привлек внимание зарубежных специалистов. Ряд выступлений по биосенсорной тематике был сделан на Соросовских конференциях учителей и по линии повышения их квалификации (Г.К.Будников).

Таблица дает перечень названий тем диссертаций и времени их защиты, объединенных понятиями биосенсоры или ферменты (биоматериалы).

Благодаря стажировке А.Н.Иванова в техническом университете г.Будапешта начали изготавливать сурьмяные потенциометрические электроды. Профессор Х.З.Брайнина, постоянный партнер кафедры по ряду вопросов электроанализа, любезно предоставила для исследований первые образцы планарных эпоксиграфитовых и печатных амперометрических электродов. Продолжается апробация биосенсоров в реальных природоохранных исследованиях. Опытные образцы и технологии получения ферментсодержащих препаратов передаются в Центральную специализированную инспекцию аналитического контроля Минприроды Татарстана и России, ГЕОХИ им.В.И.Вернадского РАН, научные учреждения г.г. Перми, Ростова-на-Дону, Казани. Более двух лет ведутся совместные исследования сектором биотестирования Минприроды РТ по оценке токсичности промышленных сточных вод. Защищены кандидатские диссертации Е.Р.Ризаевой и Е.Е.Стойковой. Например, Е.Е.Стойкова разработала колориметрические ферментные тесты на основе препаратов бутирил холинэстеразы, извлеченной из сыворотки крови лошади, и микробиальной холинэстеразы. Стабилизация ферментов осуществлялась путем включения в твердые растворы на основе N-фталилхитозана, полиглюкина или -декстрана. Эти тесты предназначались для определения ингибиторов ферментов в водных системах на уровне ПДК. Было показано, что аналитические характеристики определения обратимых и необратимых ингибиторов ферментов зависят от природы стабилизатора, субстрата и буферного раствора. Была предложена оригинальная процедура, позволяющая значительно повысить чувствительность определения. Она состоит в предварительном электролизе испытуемого раствора в присутствии хлорида натрия. При этом электрогенерированный хлор окисляет тионовые фосфорорганические соединения и аминофосфонаты до более активных ингибиторов.

С 1995 года исследования поддержаны научными грантами федеральных программ. Продолжает развиваться международное сотрудничество с венгерскими (проф.К.Тот) и французскими (проф.Ж.-Л.Марти) исследователями. Публикуются совместные статьи, а также обзоры в ряде международных журналов. На сессии НСАХ в 1998 году вновь делается доклад по перспективам применения биосенсоров в решении проблем охраны окружающей среды (Г.К.Будников).

Как обобщение полученных результатов и научный итог этапа - успешная защита в 1999 году докторской диссертации Г.А.Евтюгина (02.00.02 - аналитическая химия) на тему "Электрохимические биосенсоры на основе холинэстеразы для группового определения токсикантов и диагностики загрязнения объектов окружающей среды" на Совете при химическом факультете Саратовского государственного университета и его выступление с докладом на X Российско-японском семинаре по аналитической химии (Москва, 2000 г.).

Г.А.Евтюгин по результатам комплексного изучения закономерностей функционирования электрохимических биосенсоров на основе холинэстеразы, иммобилизованной на различных носителях, установил, что на аналитические характеристики определения ингибиторов помимо фермент-ингибиторной специфичности влияют процессы переноса ингибиторов через границу мембрана-раствор. Сорбция гидрофобных молекул пестицидов повышает чувствительность их определения и снижает пределы обнаружения по сравнению с использованием нативного фермента. Сорбционное накопление зависит как от гидрофобно-гидрофильного баланса на поверхности мембраны, так и от условий проведения измерения.

Были предложены новые способы направленного изменения характеристик ферментсодержащих мембран и биосенсоров на их основе, состоящие в выборе материала носителя фермента, использовании добавок неионогенных ПАВ и проведении измерения в нестационарных условиях в потоке.

Было показано, что защитное действие эффекторов холинэстеразы (ионы тяжелых и токсичных металлов, гидразоны, фториды), снижающее чувствительность определения фосфорорганических пестицидов, опосредуется гидролитическими и сорбционными процессами в ферментсодержащей мембране. При иммобилизации фермента действие эффекторов ослабляется благодаря изменению рН микроокружения фермента вследствие торможения выноса продуктов ферментативной реакции в раствор и буферных свойств носителя фермента.

Выявленные закономерности функционирования электрохимических биосенсоров на основе холинэстераз, предназначенных для определения ингибиторов - загрязнителей окружающей среды, значительно расширяют потенциальную сферу применения биосенсоров в эколого-аналитическом контроле. Возможность целенаправленного регулирования чувствительности и селективности биосенсоров путем подбора носителя, оптимизации состава реакционной среды и процедуры измерения позволяют адаптировать биосенсор к конкретной аналитической задаче и повысить селективность определения отдельных групп токсикантов (пестициды, обратимые ингибиторы и т.д.). Простота использования сменных накладных мембран, комплекс разработанных упрощенных методик пробоподготовки облегчают использование биосенсоров в полевых условиях, непосредственно по месту пробоотбора. Наконец, использование биосенсора для обобщенной оценки загрязненности (токсичности) сточных вод позволит значительно расширить сферу экологического контроля промышленных стоков, в том числе на предприятиях биологической очистки сточных вод при входном контроле их токсичности.

Работа Г.А.Евтюгина заметно продвинула исследования в области биосенсорики в КГУ.

Обзор мировых исследований и собственный опыт по биосенсорике привели к заключению о возможности некоторого сокращения объема работ в области холинэстеразных биосенсоров, но при расширении всего спектра проводимых исследований. В конце 2000 года интерес в области биосенсорики направлен на:

- изучение различных способов модификации поверхности электродов с целью улучшения операционных характеристик биосенсоров и расширение области их применения, включение в состав биосенсоров компонентов иммунохимических реакций, электропроводящих слоев полимеров, комплексообразователей;

- расширение круга используемых ферментов, применение оксиредуктаз (пероксидаза, цитохромы) с целью определения их специфических ингибиторов;

- использование взаимодействия "гость-хозяин" для повышения селективности биохимических реакций и соответствующих биосенсоров. Эта идея была, в частности, озвучена в устном докладе Г.К.Будниковым на VI Международной конференции по аналитическим наукам (Азия-анализ VI, Токио, 2001г).

В этот период активно устанавливаются новые контакты с представителями смежных специальностей: токсикологами, биохимиками, органиками-синтетиками, т.е. исследования по биосенсорике окончательно приобретают междисциплинарный характер.
Темы диссертаций на соискание ученой степени кандидата химических наук, выполненных по тематике биосенсоров в Казанском университета




Тема диссертации



Соискатель



Специальность



Год

защиты


в совете КГУ

1.

2.

3.


4.

5.

6.



7.

8.


9.

10.

11.

12.


Аналитические возможности биохимического сенсора на основе иммобилизованной холинэстеразы
Амперометрический холинэстеразный биосенсор в анализе биологически активных соединений
Применение холинэстеразных биосенсоров в анализе объектов окружающей среды и контроле качества вод *)

Характеристика

амперометрического холинэстеразного биосенсора как нестандартного средства измерения
Влияние модуляторов на каталитическую активность иммобилизованной холинэстеразы: аналитический аспект
Электрохимические биосенсоры на основе некоторых гидролаз и оксидаз для определения биологически активных соединений
Экспресс - определение загрязнителей окружающей среды с помощью ферментативных колориметрических тестов
Биохимическая диагностика загрязнения объектов окружающей среды
Новые варианты иммунохимического анализа с вольтамперометрическим контролем
Ионы металлов как метки для определения иммунореагентов

Сравнительная характеристика амперометрических холинэстеразных сенсоров на основе углеродистых материалов для детектирования остаточных количеств пестицидов


Иммобилизованная ДНК как реагент для вольтамперометрического определения низко- и высокомолекулярных эффекторов


Бабкина С.С.

Ли Фа-Шень

Искандеров Р.Р.

Федосеева

О.В.

Вертлиб М.Г.

Кремлева Н.В.

Стойкова Е.Е.

Ризаева Е.П.

Кутырева М.П.


Дыхал Ю.И.


Гоголь Э.В.

Зявкина Ю.И.


02.00.02- аналитическая химия
02.00.02- аналитическая химия

11.00.11- охрана окружающей среды; 03.00.23

- биотехнология

02.00.02- аналитическая химия

02.00.02- аналитическая химия

02.00.02- аналитическая химия

02.00.02- аналитическая химия

03.00.16- экология


02.00.02- аналитическая химия

02.00.02- аналитическая химия
03.00.16- экология

02.00.02 -

аналитическая химия



1990

1992


1993

1996


1996

1997


1999

1998

1999

2000



2000

2000

*) Диссертация была защищена на Совете при КГТУ.
Работу Дыхал Ю.И. в принципе можно отнести к разделу, посвященному изучению реакций каталитического выделения водорода на ртутном электроде. В ней с применением этих реакций разработаны новые варианты иммунохимического анализа. По каталитическим токам выделения водорода в присутствии ионов переходных металлов (в основном кобальта (II)), выполняющих функцию меток, были оценены биоспецифические взаимодействия. Оказалось возможным включить в нитроцеллюлозную пленку антитела против РНКазы при сохранении их способности к иммунохимическим взаимодействиям в течение месяца. Это позволило предложить вариант иммунохимического анализа РНКазы с использованием ионов кобальта (II) в качестве метки.

Каталитическое выделение водорода было обнаружено, в частности, в растворе ионов кобальта (II) в присутствии нативных антител против вируса Phoma Betae в области концентраций до 5 . 10-11 мг/мл. Хотя использование принципов вольтамперометрии с каталитическим выделением водорода на ртутном электроде уже давно стало классическим способом решения аналитических задач, однако при изучении сложных биохимических объектов они дают новые результаты.

В диссертации Э.В.Гоголь были разработаны новые амперометрические холинэстеразные сенсоры на основе углеродистых композиций и модифицирующих материалов, обладающих улучшенными операционными и аналитическими характеристиками определения остаточных количеств фосфорорганических (хлорпирифос, трихлорфон, кумафос) и карбаминатных (метиокарб) пестицидов.

Было показано, что электростатическое торможение переноса ионных компонентов реакции, создаваемое модифицирующим слоем нафиона, увеличивает время их жизни до 6 месяцев, снижает мешающее влияние ионов - эффекторов фермента и увеличивает долгосрочную стабильность отклика. Чувствительность определения фосфорорганических и карбаминатных пестицидов в 1,5-2 раза выше, а предел обнаружения - в 2-5 раз ниже, чем для биосенсоров на основе немодифицированных электродов. Было установлено, что иммобилизация холинэстеразы в парах глутарового альдегида позволяет получить сверхтонкие ферментсодержащие пленки, не создающие диффузионного торможения переноса компонентов реакции к поверхности сенсора. В результате расширяется диапазон определяемых концентраций и увеличивается чувствительность определения ингибиторов по сравнению с толстослойными мембранами, получаемыми путем кросс-сшивки раствором глутарового альдегида. Увеличение удельной активности фермента снижает чувствительность определения необратимых ингибиторов.

В проточно-инжекционных условиях чувствительность определения пестицидов с помощью иммобилизованной холинэстеразы повышается за счет сорбционного предконцентрирования ингибиторов. Действие обратимых эффекторов снижается в результате нестационарных условий их переноса в ферментсодержащую мембрану.

Были установлены рабочие условия определения остаточных количеств пестицидов в растительном материале. Показано, что ацетон и этанол в концентрации до 25% снижают, а ацетонитрил в концентрации до 20% увеличивает активность нативной и иммобилизованной холинэстеразы. Оценка ингибирующего действия ацетонитрильных экстрактов из зерна пшеницы, ячменя, риса позволяет определять фосфорорганические пестициды на уровне установленных максимально допустимых уровней.

Работа Ю.И.Зявкиной в методическом плане не отличается от предыдущих, проведенных на кафедре аналитической химии ранее: те же пленки на основе нитроцеллюлозы, тот же ртутный стационарный электрод, иммобилизованная денатурированная ДНК, определяемые токсиканты ионы свинца и кадмия, также изученные ранее на кафедре и включенные в отчеты предыдущих лет исследований. и т.д. В этой работе практически отсутствовала новизна решений, а выводы о селективности отклика на металлы - токсиканты сделаны умозрительно. Наблюдаемые эффекты объяснены по существу так, как будто имеют дело с биосенсором, который применяли ранее, т.е. по аналогии. Да и выполнялась эта работа практически на кафедре аналитической химии с использованием всей ее инфраструктуры по существу под руководством С.С.Бабкиной, вывшего аспиранта кафедры, при активном участии Э.П.Медянцевой. Формально диссертация Ю.И.Зявкиной выполнялась в рамках аспирантуры при кафедре неорганической химии КГУ. Затем, за полгода до защиты, специальность по аспирантуре заменили неожиданно на "аналитическую химию". На предварительной защите диссертации на семинаре кафедры аналитической химии КГУ уже было трудно что-либо менять - работало требование времени (в срок!). Убрали только слово "биосенсор" из названия диссертации (ибо в работе по существу не имели дело с биосенсором) и внесли некоторые изменения, улучшающие подачу материала на официальной защите. Между прочим, официальный оппонент профессор М.И.Евгеньев профессионально отметил в своем отзыве все недостатки и промахи. Ученый Совет по защитам принял к сведению отзывы, замечания, однако не захотел портить свой имидж под занавес длительного периода своей работы, кстати благополучного и весьма продуктивного, не получившего замечаний ВАК`а РФ. Имеются в этом "деле" и другие интересные аспекты. Однако они здесь не будут рассматриваться. Следует лишь отметить, что исследования по тематике биосенсоров безусловно привлекают внимание по разным причинам. Да и сам термин "биосенсор" порой звучит заманчиво и даже загадочно. Публикации статей по биосенсорам иногда заставляют задуматься, все ли факты учитываются при организации отклика биосенсора или биосенсорного устройства, особенно когда последний имеет пространственную протяженность. Эти сомнения и послужили толчком для написания статьи дискуссионного характера "Сверхмалые дозы биохимически активных веществ и отклик биосенсоров в аналитических системах" (Г.К.Будников, Г.А.Евтюгин), опубликованной в "Журнале аналитическая химия" в разделе "Письма в редакцию. Научные дискуссии" (2001г.). Уместно привести один фрагмент из этого письма по поводу действия сверхмалых доз (СМД) и отклика биосенсоров на биохимически активные вещества (БАВ).

Попытки объяснения природы эффектов СМД находятся пока на уровне предположений, и их обсуждение за рамками данного письма. Можно лишь сказать, что помимо вполне традиционных теорий, опирающихся на специфику микроокружения биологических объектов, имеются и достаточно экзотические объяснения, например, связанные с туннельным переносом макрообъектов через активационный барьер или нарушениями в макромасштабе времени флуктуационных равновесий структуры воды.



Нельзя не отметить еще одну проблему, связанную с самой возможностью корректного исследования и обсуждения эффектов СМД. Общеизвестно, что проблемы определения ультрамикроконцентраций в экспериментальном плане отличаются деликатностью и даже некоторой опасностью для репутации ученых, на что обращали внимание специалисты, занимающиеся исследованиями в области СМД. Это связано с серьезными методическими трудностями. Работая с очень большими разбавлениями веществ, практически невозможно контролировать конечную концентрацию БАВ на уровне порядка 10-15-10-23М, даже если исследователь имеет в своем распоряжении самую чувствительную современную аппаратуру. Действительно, при использовании сильно разбавленных растворов чрезвычайно сложно избежать сорбции единичных молекул определяемого вещества на стенках не только посуды (ячейка для измерений, в которой помещен биосенсор, например), но и на составляющих элементах самого биосенсора или иного измерительного устройства. Особенно трудно учесть вклад сорбционной составляющей, когда измерительное устройство имеет сложную составную конструкцию. Речь идет о наличии мембраны большой площади, физическом преобразователе, коммуникациях, системах ввода проб и прокачки растворов и т.д. Даже абстрагируясь от проблемы сорбционных эффектов, трудно учесть неравномерность распределения молекул БАВ в процессе многократного разбавления раствора.

Когда писались эти строки стало известно, что ВАК РФ особо обратил внимание на качество экспертизы диссертации в рамках специальных семинаров. Такая экспертиза, правда, относилась прежде всего к докторским работам и должна всегда предшествовать официальной защите, что должно помочь без суеты дать объективную оценку диссертациям.


Поделитесь с Вашими друзьями:


База данных защищена авторским правом ©znate.ru 2019
обратиться к администрации

    Главная страница